实时荧光定量 PCR：了解 Ct

为了比较不同条件（例如两种不同的预混液或两台不同的仪器）下的两个反应，必须评估以下参数。 动态范围 为了正确地评估 PCR 效率，至少需

为了比较不同条件（例如两种不同的预混液或两台不同的仪器）下的两个反应，必须评估以下参数。

动态范围

为了正确地评估 PCR 效率，至少需要 3 次重复和至少 5 个数量级倍数的模板浓度。图 6 说了建议此精确级别的理由，它证明在 1 个数量级倍数与 5 个数量级倍数范围内测试稀释模板时，获得的斜率或效率可能产生数学偏差。因此，即使检测 100% 有效，由于每个稀释点都存在标准差，检测一个数量级倍数的连续稀释时，可能获得 70 至 170% 的范围。在 5 个数量级倍数范围内做相同数量的稀释点或重复，可能的偏移只有 ±8%。这意味着在 5 个数量级倍数范围内，如果效率为 94%，则该实验的效率范围介于 88% 到 100% 之间。为了准确测定 PCR 反应的效率，必须进行 5 个数量级倍数的连续稀释。-3.3 ±10% 的斜率意味着效率达到 100% ±±10%。PCR 反应效率越低，那么灵敏度越低。

R2 值

另一个评估 PCR 效率的关键参数是 R2，它是说明如何使用一个数值预测另一个数值的相关程度的统计学术语。如果 R2 为 1，那么 Y 值 (Ct) 可以用来准确预测 X 值（图7A）。如果 R2 为 0，那么就不能通过 Y 值预测 X 值（图 7B）。R2 值 >0.99 表示两个数值之间相关的置信度良好。

精确度

标准差（偏差的平方根）是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值，则标准差就小；如果许多数据点都远离平均值，则标准差就大。

实际上，足够多重复次数产生的数据集会形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限定理来证明，该定理称大量独立同分布随机变量的和在无限多时趋向于正态分布。如图 8A 所示，约 68% 的值在平均值的 1 个标准差之内，约 95% 的值在平均值的 2 个标准差之内，约 99.7% 的值在平均值的 3 个标准差之内。

如果 PCR 效率为 100%，那么 2 倍稀释时两个连续浓度之间的 Ct 差为1（图 8B）。要在 99.7% 以上的情况下定量 2 倍稀释，标准差必须 ≤0.167。标准差越大，分辨 2 倍稀释的能力就越低。要在 95% 以上的情况下区别 2 倍稀释，标准差必须 ≤0.250（图 8C）。

灵敏度

无论 Ct 绝对值是多少，任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为 1 的系统都达到了灵敏度的极限。

如前文所述，效率是决定反应灵敏度的关键因素（图 5）。在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是，不能预期模板为正态分布。相反，它会遵循泊松分布，该分布预测在平均包含一个拷贝的起始模板的大量重复中，实际上约 37% 不含拷贝，仅有约 37% 含有 1 个拷贝，18% 应包含 2 个拷贝（见图 9）。因此，为了可靠地检测低拷贝，必须做大量的重复实验来提供统计显著性，以克服泊松分布的限制。

图 6. 准确计算 PCR 效率取决于连续稀释所用模板量的范围。对于具有 5 个稀释点的 2 倍稀释（橙色）而言，其可能的偏移高于具有 5 个稀释点的 10 倍稀释（蓝色）。

图 7.为 2 条直线计算出 R2 值的示例。(A) x 和 y 值直接相关。(B) x 和 y 值无关。

图 8.正态分布和标准差。(A) 已显示数据的正态分布。PCR 效率为 100% 时，2 倍连续稀释中的两个连续样品的平均值之间的 Ct 之差为1（样品 X 和样品 Y）。(B) 为了能够在 99.7% 的情况下为两个样品定量，标准差必须低于 1 个 Ct 除以 6 个标准差的值 (1/6 = 0.167)。(C) 为了能够在 95% 的情况下为两个样品定量，标准差必须低于 1 个 Ct 除以 4 个标准差的值 (1/4 = 0.25) 。

图 9.低拷贝数的泊松分布。蓝色曲线代表 3.3 pg DNA（1 个 DNA 拷贝）的泊松分布。粉色曲线代表 6.6 pg DNA（1 个细胞，2 个 DNA 拷贝）的泊松分布。

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